无糖培养

植物无糖组织培养技术（Sugar-free micropropagation）又称为光自养微繁殖技术（Photoautotrophic micropropagation）是指在植物组织培养中改变碳源的种类，以CO2代替糖作为植物体的碳源，通过输入CO2气体作为碳源，并控制影响试管苗生长发育的环境因子，促进植株光合作用，使试管苗由兼养型转变为自养型，进而生产优质种苗的一种新的植物微繁殖技术。这一技术概念是在1980年提出的，其技术发明人是日本千叶大学的古在丰树教授。20世纪90年代以后，这一技术成为植物微繁殖研究的新领域，受到广泛的关注，无糖组织培养技术也在各国开始得到推广应用。特别是近几年来，从事这一技术领域研究的科技人员越来越多，这一技术也逐渐成熟，并开始应用于植物微繁殖工厂化生产。本文从植物无糖组织培养技术的特点、优势、限制因素、研究进展和应用前景等方面对这一技术进行了综述。

（一）植物无糖组织培养技术特点

1.CO2代替了糖作为植物体的碳源

 在一般的有糖培养微繁殖中，小植物是以糖（如蔗糖、白砂糖、果糖等）作为主要碳源进行异养或兼养生长，糖被看作是植物组织培养中必不可少的物质添加到培养基中。而无糖培养微繁殖是以CO2作为小植株的唯一碳源，通过自然或强制性换气系统供给小植株生长所需CO2，促进植物的光合作用进行自养生长。

2.环境控制促进植株的光合速率

在传统的组织培养中，很少对植株生长的微环境进行研究，研究的重点是放在培养基的配方以及激素的用量和有机物质的添加上；而无糖组织培养技术是建立在对培养容器内环境控制的基础上，根据容器中植株生长所需的最佳环境条件（如光照强度、CO2浓度、环境湿度、温度、培养基质等）来对植株生长的微环境进行控制，最大限度地提高小植株的光合速率，促进植株的生长。

3.使用多功能大型培养容器

在传统的组织培养中，由于培养基中糖的存在，为了防止污染，一般使用或者说只能使用小的培养容器。而无糖培养在培养过程中不使用糖及各类有机物质，极大地避免了污染的发生，可以使用各种类型的培养容器，小至试管，大至培养室。

4.多孔的无机材料作为培养基质

在传统的组织培养中，通常使用琼脂作为培养基质，而无糖培养主要是采用多孔的无机物质，如蛭石、珍珠岩、纤维、Florialite（一种蛭石和纤维的混合物）作为培养基质，可以极大地提高小植株的生根率和生根质量

5.闭锁型培养室

传统组织培养中的培养室是半开放的，有许多的窗户以利于阳光直接进入培养室，但自然光在进入培养室的同时也增加了降温的成本，而且，一年四季、春夏秋冬，晴天、阴天、雨天，早晨、中午、下午、光的强度和分布是不均匀的。而无糖培养采用的是闭锁型的培养室，通过人工或自动调控整个培养室环境，能周年进行稳定的生产。

（二）植物无糖组织培养技术的优势

植物无糖组织培养技术改革了传统的用糖和瓶子作为碳源营养和生存空间的技术方法，增加了植物生长和生化反应所需的物质流的交换和循环，促进植株的生长和发育，实现了优质苗低成本的生产。优越如下：

1.通过人工控制动态调整优化植物生长环境，为种苗繁殖生长提供最佳的CO2浓度、光照、湿度、温度等环境条件，提高植株的光合速率，促进了植株的生长发育，苗齐、苗壮。

2.继代与生根培养过程合二为一，培养周期缩短了40％以上。

3.大幅度减少了植物微繁殖生产过程中的微生物污染率。 

4.消除了小植株生理和形态方面的紊乱，种苗质量显著提高。

5.提高了植株的生根率和生根质量，特别是对于木本植物来说，极大地植株的生根率和生根质量，试管苗移栽成活率显著提高。

6.节省投资，降低生产成本。与传统的微繁殖技术相比，种苗生产综合成本平均降低30％。

7.组培生产工艺的简单化，流程缩短，技术和设备的集成度提高，降低了操作技术难度和劳动作业强度，更易于在规模化生产上推广应用。

8.培养不受培养容器的限制，可实现穴盘苗商业化生产，也可实现大规模容器自动工厂化生产。

（三）植物无糖组织培养技术的限制因素

1.需要相对复杂的微环境（容器内环境）控制的知识和技巧

植物无糖组织培养微繁殖的研究和试验已经非常成功，但实际应用还是受到一定的限制，其中的一个主要原因就是需要应用微环境控制方面专业的技术。没有充分理解容器中小植株的生理特性，容器内的环境，容器外的环境，培养容器的物理或构造特性之间的关系，将不可能成功地应用光自养微繁殖系统，使用最少的能源和原料生产高品质的植株。光自养微繁殖控制系统的复杂性会导致设施设计的失败，必须在充分认识和理解了光自养微繁殖的原理后，才能取得成功。

2.培养的植物材料受到限制

与一般的微繁殖相比，光自养微繁殖需要较高质量的芽和茎，外植体需具有一定的叶面积，带绿色子叶的体细胞胚也可进行光自养生长。外植体的质量越好培养效果越佳。

（四）植物无糖组织培养技术研究进展

植物无糖组织培养技术经过近20年的发展，基础理论的建立和研究已经成熟，但商业化的应用还处于起步阶段。在植物无糖组织快繁技术的应用中，CO2的供给和浓度的调控是其关键技术之一。在植物无糖组织培养过程中，为了增加培养容器中的CO2浓度，可采用两种不同的CO2补充方式，一种是在密封的容器上使用透气膜，通过自然换气方式提供小植株光合作用所需的CO2。随着无糖组织培养培养容器的不断增大，强制性换气系统得到了应用。与自然换气相比，强制性换气具有CO2浓度容易控制，操用方便，植物生长发育加快等特点。Xiao等（2005）在对calla lily和China fir进行的无糖培养研究表明，采用120L的培养容器，通过强制性换气系统直接输入CO2供植物生长。与传统组织培养方式（培养基中添加蔗糖）相比，calla lily的培养周期缩短50%、苗木移栽成活率由50%提高到95%；China fir苗木质量显著提高，继代和生根过程合二为一，且没有愈伤组织的发生，而有糖培养则在基部产生愈伤组织，严重影响苗木移栽成活率。Xiao等(2005)对Gerberas进行的无糖培养研究表明，与有糖培养相比，采用大规模容器和强制性换气系统进行的无糖组织培养，植株的叶面积、茎干重分别提高5.2和4.6倍，植株的净光合速率和叶绿素含量分别提高9.2和2.2倍，苗木生根率和移栽成活率分别由62%、57%提高到98%、95%。进行桉树的无糖组织培养研究表明，一种新型的小培养容器Vitron能提高试管苗在无糖培养条件下的生长质量，适合进行无糖组织培养生产。

在植物无糖组织培养中，培养基质对试管苗生长来说也是一个非常重要的因素。Afreen～Zobayed等（1999）对甘薯进行了琼脂、gellan gum、蛭石、cellulose和Florialite等五种不同培养基质的无糖培养比较试验，研究结果表明，以Florialite为培养基质生产的试管苗质量优于以琼脂作为培养基质产生的试管苗，其中叶、根鲜重分别是后者的2.4和2.9倍，干重分别是后者的2.2和2.8倍，且以Florialite为基质产生的试管苗净光合速率最高。Xiao等（2006）对statice进行的无糖组织培养研究也表明，与琼脂相比，Florialite显著提高试管苗生长和根的发生，以及净光合速率（图8-6）。另外，光量子通量培养容器换气次数等环境因子均对试管苗生长产生影响。

  到目前为止，植物无糖组织培养技术已经在60余种植物中获得成功。与有糖培养相比，无糖组织培养技术显示出其特有的优势。特别是对于木本植物来说，无糖组织培养技术能显著改善根的质量，提高生根率，消除了小植株生理和形态方面的紊乱，种苗质量显著提高，以咖啡植物作为研究对象，利用无糖组织培养技术进行了大量体细胞胚胎发生方面的研究，研究结果表明，无糖组织培养能提高体细胞的质量，减少玻璃化和不正常体细胞胚发生机率，而且体细胞发生发育时期、大小比较均匀，便于工厂化生产。研究指出，无糖组织培养技术可能成为体细胞胚胎发生机理研究的有效工具或途径。随着无糖组织培养技术的不断完善和成熟，这一技术已经开始在商业上慢慢得到应用和推广。

（五）植物无糖组织培养技术应用前景

无糖组织培养微繁殖技术作为一项高新技术，在基础科学研究和实践生产中均具有广阔的应用前景。

1.在无糖组织培养过程中，主要是通过环境调节来促进试管苗生长。因此，可以从环境调节角度来研究试管苗形态建成、生长发育机理等方面的基础科学研究。

2.无糖组织培养技术可有效解决藤木、木本植物生根难的问题，可进行这方面的应用基础研究。

3.可进行试管苗继代、生根、驯化同步研究，缩短培养周期。 

4.可进行濒危珍稀植物及高附加值植物的人工培育等方面研究。

5.可进行种质资源保存方面的研究。

6.随着材料科学、物理农业的发展，以及植物无糖组织培养技术理论体系的成熟，这一技术将以低成本生产高质量种苗的优势，应用于植物种苗工厂化生产。

三、浸没式培养

自20世纪80年代中期开始，西方国家开始了大规模液体浸没组织培养的研究， 到90年代中后期取得了突破性进展，为商业化生产苗木打下了坚实的基础。 国内研究起步晚，且主要集中在次生代谢产物的生产上，目的在于降低成本。目前，实现苗木商业化生产的大规模组织培养研究尚未有报道。间歇浸没式繁殖效率高，成本低，在林木育种方面具有巨大的应用潜力。

1.间歇式浸没式培养系统概述

目前，常用的半固体培养劳动力密集，成本高；而液体培养虽然具有更多特点适应大规模生产，降低成本，但是玻璃化畸形等生理问题比较严重。因此,2种方法都无法实现提高效率和降低成本的市场化要求。因此，改善培养工艺，建立新的培养方法体系，减少劳动力耗费，实现自动化培养是降低成本实现商业生产的一种趋势。最早使用微生物发酵罐来进行植物组织培养，但是由于成本以及植物的特点的限制而失败。针对植物组织培养的特点，经过30年的简化和完善， 出现了多种专用于植物组织培养生物反应器， 如筏式生物反应器， 喷雾式生物反应器等。其中间歇浸没培养应用最为广泛，包括完全浸没间歇培养和半浸没间歇培养。间歇浸没式生物反应器有多种类型，在这些生物反应器中比较成熟的，具有代表性的主要有以下几种。

（1）APCS间歇完全浸没培养系统。最早的间歇式浸没系统出现在1985年， 由Tisserat和Vandercook设计了植物自动培养系统，简称APCS为系统。整个系统有4个部分组成：营养液储存系统有2个营养蓄水池组成；营养液驱动系统由2个叶轮推动器组成；植物培养系统是1个大的玻璃培养腔；营养液运输系统由硅胶树脂管组成。整个系统在叶轮驱动下实现了液体的定期补充和排干，获得了与手工培养同样的效果，却没有了繁琐的更新操作。APCS系统培养的兰花芽尖的数量是半固体培养的芽尖数量的4倍，而且其中的植物生长更快更好。该系统培养明显减少了劳动消耗。

（2）蠕动泵驱动间歇半浸没培养系统。20世纪80年代末，Aitken.Christie等改进了APCS系统，形成了1套半自动 培养系统，该系统使用了1个巨大的聚碳酸酯培养容器（250mm×390mm×120mm）。在培养容器内，辐射松首先在固体培养基上培养1个月，然后利用蠕动泵和定时器 达到营养液的自动化间歇更新，最终实现了对辐射松的间歇半浸没培养。液体更新每次30～40ml，需6～7h，每周2次。在供给营养液的时候，注意保持气体供应，保证苗的需氧量，通气培养比不通气培养效果好。

  在此基础上，1991年，Simonton等设计了1套计算机控制泵实现液体间歇供应的系统，有4个培养容器，用带孔聚丙烯作为支撑代替琼脂培养基，这样能够控制营养液的高度，使营养循环能够按照预定设计进行。上述3种培养系统都是采用了外界机械动力作为驱动力，利用控制程序实现营养液的间歇供给和排干，减少了劳动力耗费，降低了成本。但是由于营养周期长，操作复杂，污染和空间限制问题比较严重。

（3）气泵驱动RITA间歇浸没式生物反应器。1993年，Ralvard等设计了一套间歇浸没控制系统，该系统有2个容器组成，下面的是营养液储存容器，上面是培养容器。中间有管道相连，利用气压泵产生的气压作为动力，迫使培养液从营养液储存容器通过中心管道流入培养容器，与整个培养物的完全接触，同时引起气体流动，实现培养容器空气的更新。气体进入营养液储存器时，都经过22um 的滤膜防止污染。系统进入市场后正式命名为The Recipient for Automated Temporary Immersion system，简称为RITA( 图8-7)。应用该系统通过多种培养方式对香蕉培养，发现间歇浸没培养的繁殖率最高，为其他培养方法的 2～3倍，干重是其他培养方法的2～5倍，整个系统简单易用。1995年已经投入市场，实现了多个植物物种的大规模。但是系统容器体积小，构造复杂，价格较贵，这些都限制了这套培养控制系统在发展中国家的推广应用。

 （4）BIT间歇浸没式生物反器。在RITA设计的基础上，Escalona等设计了2个容器分开的气体驱动间歇浸没生物反应器，称为The Twin Flask system，商品为BIT（图8-8）。培养容器的大小可以改变，而且构造简单，价格便宜。2个容器通过玻璃管或者硅管连接，气体通过0.2um的滤膜除菌；使用了2个空气压缩机来实现营养液的供给和排干。使用该系统，以2min/3h的浸没频率供给营养，同时也完成了气体更新，在含有多效唑的培养基中培养42d后，明显提高了繁殖率，增加了干重和湿重；7周后获得了最大的繁殖率。1996年，大规模培养获得的菠萝苗比用传统方法获得的苗成本减少20％。上述4种间歇浸没式生物反应器是不同时期具有代表性的成果。前2种由于污染和空间问题没有得到广泛应用，后2种采用了双瓶式，但原理上是一样的，利用气压实现间歇浸没，液体更换中保证无菌过滤，大大降低了污染率，在一定程度上降低了成本，提高了效率，已经应用于多个具有医药学价值的树种、经济树种和林学应用树种的大规模育苗

研究。

2、间歇式浸没培养优势  

大部分树种的培养试验，都对间歇浸没培养和半固体培养、液体培养作了比较，认为应用于组织培养的中后期效果较好。以半固体培养基获得的小苗或者芽为培养材料，来进行芽分化增殖和驯化，其优势有：①在计算机程序的辅助下实现了营养液的自动化控制供应和排干，增加了技术含量，减小了劳动密度，节约了大量的劳动力，降低了成本；②间歇浸没，避免或者减少了液体培养中畸形苗和高度玻璃化苗的比例；③利用液体培养基的自动供给，能够达到较为一致的培养环境和培养状态；④与微生物反应器比较，在控制精度相似的情况下，剪切力降低；⑤污染减少；⑥根据培养苗发育需要，易于改变培养继成分，实现连续培养；⑦营养成分充分混合，便于营养的吸收和利用；⑧气体更新充分，氧气充足；⑨培养苗的质量提高，干重，湿重，繁殖率都明显提高，驯化成活率也高达90%以上。间歇浸没培养的1个重要的特点就是使培养物与营养液和气体间歇大面积接触，既保证了合适的养分吸收，又能提供充分的氧气供应，保证了培养的生长速度和生长质量。培养过程中的其他参数，如浸没频率、容器体积、营养液体积和培养时间等也是影响培养物质量的因素。