思考题：

1.    免疫细胞分离的基本原理（密度、黏附吞噬、表面标志、生长因子）应用于哪些细胞？

2.   细胞因子检测的三大基本方法（原理、优缺点）

3.   FACS法测CD分子的基本原理

1.    MACS法分离细胞的原理

2.    ELISA和ELISPOT实验原理

3.    T细胞增殖试验的基本原理、基本方法

4.    细胞凋亡的测定原理和方法

8.   概括免疫学技术主要内容

9.   单克隆抗体制备的原理和基本过程

10.   凝集、沉淀反应的主要方法（名称和基本原理）

11.   各种免疫标记技术的标记物及示踪原理

12.   免疫荧光技术的各种实验策略

13.   ELISA的基本原理和各种实验策略

14.   Western blot的基本原理

1.ELISA技术原理和实验策略

ELISA全名为酶联免疫吸附试验。原理是将抗原或抗体包被在固相载表面，并保留其免疫活性，然后再与酶标抗体（或酶标抗原）联结，并保留酶活性。洗去游离的酶标抗体（或酶标抗原），然后加入酶反应的底物，底物被酶催化变成有色产物。反映颜色深浅与相应的抗原或抗体的量相关，据此进行定性和定量分析。

主要的实验策略有：

双抗体夹心法：此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原。将待分析物的特异性抗体与固相载体连接形成固相抗体，经封闭和洗涤后加受检标本（抗原）形成固相抗体－抗原复合物，洗涤后再加酶标抗体生成抗体-待测抗原-酶标记抗体的复合物，洗涤和底物显色。根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量测定

双位点一步法：在双抗夹心基础上，改为应用针对抗原分子上两个不同决定簇的两种单克隆抗体分别作为固相抗体和酶标抗体。其优点是测定时标本可与酶标抗体同时加入进行结合反应，两种抗体互不干扰。省时简便。但是当待测抗原浓度过高时，可出现假阴性结果。

间接法：检测抗体最常用的方法，其原理为利用酶标记的抗抗体以检测已与固相结合的受检抗体，故称为间接法。用已知抗原包被固相载体，加待检标本与固相抗原结合，洗涤后加酶标抗抗体与固相载体上抗原抗体复合物结合，经洗涤，底物显色，根据颜色反应的程度进行该抗体的定性或定量测定

竞争法：此法可用于抗原和半抗原的定量测定，也可用于测定抗体。用已知特异性抗体包被固相载体。测定管加待测抗原和一定量的酶标抗原使二者与固相抗体竞争结合，对照管只加一定量酶标抗原与固相抗体直接结合。经洗涤，底物显色，分别测定两管的吸光度值，根据对照管与测定管吸光度值之比，计算标本中待测抗原含量。对照管由于只加酶标抗原，与固相抗体充分结合，故分解底物显色深；测定管的显色程度则随待测抗原和酶标抗原与固相抗体竞争结合的结果而异。如待测抗原量多，竞争性地抑制酶标抗原与固相抗体结合，使固相上结合的酶标抗原量减少。加入底物后显色反应较弱，两者呈负相关。

ABS-ELISA法：ABS即亲和素-生物素系统，每个亲和素分子能结合4个生物素。通过亲和素-生物素系统与酶偶联能产生更大的放大效应以提高灵敏度。

2.ELISPOT技术原理和技术特点

ELISPOT全名为酶联免疫斑点检测，结合了细胞培养技术与ELISA技术，能够在单细胞水平检测细胞因子的分泌情况。其技术原理简单讲就是：用抗体捕获培养中的细胞分泌的细胞因子，并以酶联斑点显色的方式将其表现出来。细胞受到刺激后局部产生细胞因子，此细胞因子被特异单克隆抗体捕获。细胞分解后，被捕获的细胞因子与生物素标记的二抗结合，然后用酶标亲和素再与生物素结合，进行化学酶联显色，PVDF孔板出现“紫色”的斑点表明细胞产生了细胞因子，通过ELISPOT 酶联斑点分析系统对斑点的分析后得出结果。

实验设计在96孔培养板上进行，直接以培养板的塑料板底或者PVDF膜以及硝酸纤维素膜为基质，包被上特异性的单克隆抗体，用以捕获细胞分泌的细胞因子。在特异性的抗原或者非特异性的有丝分裂原的刺激下，数小时之内，T细胞就会开始分泌各种细胞因子。细胞因子当即就被位于细胞下方的膜上的单克隆抗体所捕获。在洗去细胞之后，被捕获的细胞因子可以与生物素标记的第二抗体结合，然后用酶标亲和素再与生物素结合，进行化学酶联显色，就可以在膜的局部形成一个个圆形的斑点。

3. Western blot的基本原理

通过电泳区分不同的组分并转移到固相载体上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的蛋白成分。Western印迹技术结合了凝胶电泳的高分辨率和固相免疫测定的特异敏感等多种特点，可检测到低至1～5ng（最低可到10－100pg）中等大小的靶蛋白。

用于western的抗体和用于ELISA的抗体有什么不同的要求？

答：一般来说用于western的抗体识别的是氨基酸序列特异性； 而用于ELISA的抗体则要看抗原种类，有些是识别氨基酸序列特异性，有些是识别构像特异性。所以一般根据抗体说明书来确定。

4.免疫荧光技术的示踪原理和各种实验策略（IF）

原理：根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光素制成荧光标记物，再用这种荧光抗体（或抗原）作为分子探针检查细胞或组织内的相应抗原（或抗体）。在细胞或组织中形成的抗原抗体复合物上含有荧光素，利用荧光显微镜观察标本，荧光素受激发光的照射而发出明亮的荧光，可以看见荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质、定位，以及利用定量技术测定含量。

直接法：荧光素标记的特异性抗体直接与相应抗原反应。

间接法：特异性抗体与相应抗原反应，荧光素标记的抗抗体再与第一抗体结合。

补体结合法：通过补体反应形成抗原-抗体-补体复合物，然后荧光素标记抗补体特异性抗体在与补体反应发出荧光。

双结合法：两种荧光素分别标记的两种不同的特异性抗体，与同一标本反应，荧光显微镜观察两种颜色荧光。

5.简述IF、western blot、ELISA的在应用中的区别。

免疫荧光
是融合了免疫学原理（抗原抗体特异性结合）和荧光标记技术，通过荧光激发，来对组织（细胞）内抗原进行定位、定性及定量的研究(主要是定位)。样本是细胞或组织，要在显微镜下观察结果，可能出现膜阳性、质阳性和核阳性。
ELISA（酶联免疫吸附试验）
用到了免疫学原理和化学反应显色，待测的样品多是血清、血浆、尿液、细胞或组织培养上清液，因而没有用到组织包埋、切片等技术，这是与免疫组化的主要区别，操作上 开始需要将抗原或抗体结合到固相载体表面，从而使后来形成的抗原-抗体-酶-底物复合物粘附在载体上，这就是“吸附”的含义。

WB
先要进行SDS-PAGE，然后将分离开的蛋白质样品用电转仪转移到固相载体上，而后利用抗原-抗体-标记物显色来检测样品，可以用于定性和半定量。

WB 可以看到特异性的条带，但是定量比较麻烦；只能半定量，但是可以检测细胞膜蛋白，这点ELISA做不到；所检测的一般是抗原，而ELISA抗原抗体都可以检测；所检测的抗原可以知道其分子量的大小，或是否是多聚体、降解产物等，WB可以确定所用抗体是与那种蛋白起作用的；而ELISA无能为力；一次处理量就是一块胶版，10-20个样品最多了。ELISA一块96孔板一次可以处理96个样本，可以设置多个复孔、对照、梯度样等来提高检测的可信度；ELISA可以直接读出浓度，但是如果抗体有非特异性结合，那得到的数值就不可信。

6.各种免疫标记技术的标记物及示踪原理

7.凝集、沉淀反应的主要方法（名称和基本原理）

沉淀反应的定义：是指可溶性抗原分子与特异性抗体分子在溶液或凝胶中相混合形成复合物，当两者的比例合适时，可相互作用产生较大的不溶性免疫复合物析出，出现肉眼可见的不溶性沉淀物。

根据抗原与抗体反应的环境条件及附加因素，沉淀反应可分为两种主要形式：

 1．溶液中沉淀反应：是指在清彻透明的液体中，呈溶解状态的抗原与抗体在试管内或凹玻片上混匀，可凝聚成为肉眼可见的絮状或颗粒状的不溶性沉淀物。常用的有：环状沉淀试验，免疫比浊法，免疫沉淀技术

 2．凝胶中沉淀反应：即将抗原抗体溶液放在琼脂凝胶板上的小孔中，使它们彼此对向扩散，在抗原抗体相遇的地方形成沉淀线。此沉淀线的突出性质是：特异性抗原抗体不能通过；与沉淀线无关的抗原和抗体分子则可自由通过此沉淀线。

主要包括：

单相免疫扩散试验：将混有抗体的琼脂糖溶液制成平板，在平板上打孔，加入标本，如标本中有相应抗原，会向四周扩散，在浓度比例合适的地方形成沉淀环。沉淀环的直径或面积的大小与抗原量有关。

双相免疫扩散试验：将抗原与其相应抗体放在凝胶（如琼脂）平板的邻近孔内，使们互相扩散，当扩散到两者浓度比例合适的部位相遇时，即出现沉淀线。

结果分析：1抗原或抗体的纯度；若在两孔内有两对或两对以上的抗原抗体系统，就能产生相应数量的分离的沉淀线。2抗原或抗体相对浓度：抗原浓度越高，形成的沉淀线距离抗原孔越远，抗体浓度越高，形成的沉淀线距抗体孔越远；3抗原或抗体相对分子量：抗原或抗体在琼脂内的扩散受分子量影响，分子量大者扩散速度慢，扩散圈小，局部浓度高，因此形成的沉淀圈弯向分子量大的一方，若二者分子量相等，则沉淀线呈直线；4抗原性质：观察两个邻近孔的抗原与抗体所形成的两条线是交叉抑或相连，可用来判断该两抗原是否有共同成分。同样的纯抗原a放在两个邻近的孔中，对应抗体放在中央孔中，两条沉淀线在其相邻的末端会互相连接和融合；若两个不同的抗原a和b，则两线互相交叉；若两个抗原有部分相同成分a和ab，则两线除有相连部分以外还有一伸出部分。5滴定抗体效价：固定抗原浓度，稀释抗体，出现沉淀线的最高稀释度为该抗体的效价。

免疫电泳：免疫电泳是区带电泳和双相免疫扩散两种方法的结合。将抗原先进行电泳，使其中的各种成分因电泳迁移率的不同而彼此分开。停止电泳后与电泳方向平行挖一小槽，加入含相应抗血清，再做双相免疫扩散，已分离的各抗原成分与抗体在琼脂中扩散而相遇，各区带在相应位置与Ab形成沉淀弧。

对流免疫电泳：在pH8.6的溶液中，大部分蛋白抗原带负电，在电场中向正极移动；IgG 分子量大，带的电荷少，在电场中虽也向正极移动，但速度缓慢。由于电渗引起负极移动的潮流速度超过了IgG向正极的移动，带动抗体移向负极，形成与抗原间的对流。二者相遇后，在最适比例处形成沉淀线。

火箭电泳试验：电泳时，含于琼脂凝胶中的抗体不发生移动，而在电场的作用下促使样品中的抗原向正极泳动。当抗原与抗体分子达到适当比例时，形成一个形状如火箭的不溶性免疫复合物沉淀峰，峰的高度与样本中的抗原浓度呈正相关。

凝集反应的定义：是指颗粒型抗原（如细菌，红细胞或吸附在红细胞上的抗原等）与相应抗体结合，在有适当电解质存在下，经过一定时间，可形成肉眼可见的凝集团块。

1．直接凝集反应：是将细菌或红细胞与其相应抗体结合产生的细菌凝集或红细胞凝集现象。（肥达氏反应，血型鉴定等）

2．间接凝集反应：用可溶性抗原（或抗体）包被在一种与免疫无关的、具一定大小的不溶性颗粒（即载体颗粒）的表面，然后与相应抗体（或抗原）作用，在有适宜电解质存在的条件下，结合产生的凝集现象。

（1）正向间接凝集反应：将抗原先吸附在载体表面，然后与相应抗体结合产生的凝集反应。

（2）反向间接凝集反应：将特异性抗体先吸附在载体表面，然后与相应抗原结合产生的凝集反应。

（3）间接凝集抑制反应：先将可溶性抗原加到相应抗体中，使抗体先与该可溶性抗原结合，则抗体就不能与致敏的颗粒发生凝集反应。若存在可溶性抗原，则无凝集现象。

8.概括免疫学技术主要内容

9.单克隆抗体制备的原理和基本过程

基本原理：骨髓瘤细胞在体外培养能大量无限增殖，但不能分泌特异性抗体；而抗原免疫的B淋巴细胞能产生特异性抗体，但在体外不能无限增殖。将免疫脾细胞与骨髓瘤细胞融合后形成的杂交瘤细胞，继承了两个亲代细胞的特性，既具有骨髓瘤细胞能无限制增殖的特性，又具有免疫B细胞合成和分泌特异性抗体的能力。经在HAT培养基[含有次黄嘌呤(H)、氨基喋呤(A)和胸腺嘧啶核苷(T)]中进行选择性培养，未融合的脾细胞因不能在体外长期存活而死亡；未融合的骨髓瘤细胞合成DNA的主要途径被培养基中的氨基蝶呤阻断，又因缺乏次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶（HGPRT），不能利用培养基中的次黄嘌呤完成DNA的合成过程而死亡。只有融合的杂交瘤细胞由于从脾细胞获得了HGPRT，因此能在HAT培养基中存活和增殖。经过克隆选择，可筛选出能产生特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞，在体内或体外培养，即可无限制地大量制备单克隆抗体。

基本过程：1、抗原制备；一般而言，抗原的纯度不很重要，特别是免疫原性较强的抗原。2、免疫动物；目前应用最广的是小白鼠和大白鼠，尤以小白鼠为好。3、免疫脾细胞和骨髓瘤细胞的制备；饲养细胞即在体外的细胞培养中，单个的或数量很少的细胞不易生存与繁殖，必须加入其它活的细胞才能使其生长繁殖，加入的细胞称之为饲养细胞（Feeder cell）。4、细胞融合；5、杂交瘤细胞的选择培养；6、杂交瘤细胞的筛选和克隆化；7、杂交瘤细胞的冻存；8、单克隆抗体的检定；9、分泌单克隆抗体杂交瘤细胞系的建立；10、单克隆抗体大量制备。

11.细胞因子检测的三大基本方法（原理、优缺点）

细胞因子定义：是由活化的免疫细胞及某些基质细胞表达并分泌的活性物质，其主要生物学功能是介导和调节免疫应答及炎症反应，其化学本质是蛋白质或多肽。

免疫学检测方法——抗原性检测：其原理是细胞因子与相应的特异性抗体结合，通过荧光素，酶等免疫标记技术进行放大和显示，从而定性或定量的显示细胞因子的水平。主要包括：

ELISA；流式细胞分析法；ELISPOT

1.优点：特异性高，操作简便。缺点：只测定量，不能定其活性；测定结果和抗体来源和亲和力有很大关系，使用不同来源和亲和力的单抗，对同一标本测定得到的结果可能不同；敏感性不高；标本中存在细胞因子受体，影响检测结果；标本中存在细胞因子抗体或细胞因子载体可干扰其测定。

细胞生物学检测方法——生物活性检测：其原理是根据细胞因子对特定的依赖性细胞株（即靶细胞）的促增殖作用，以增殖细胞中的DNA合成或酶活性为指标，间接推算出细胞因子的生物学活性单位。主要包括：

细胞增殖或增殖抑制试验；细胞病变抑制试验；细胞毒试验；细胞趋化试验

分子生物学检测方法——基因表达检测：其原理是从蛋白质水平来检测细胞因子经常因为细胞因子含量低而受到限制，根据细胞因子的分泌表达是通过基因表达的改变来调节的。利用细胞因子的cDNA探针或根据已知的核苷酸序列人工合成寡聚核苷酸探针。检测mRNA 以反映基因表达和功能。主要包括：

原位杂交技术；Northern 印迹；核糖核酸酶保护分析 ( RPA)；Rt-PCR技术

12. FACS法测CD分子的基本原理

是在一组混合的细胞群中，加入特异的针对特定靶细胞表面分子的荧光标记单克隆抗体，经抗原抗体反应荧光标记抗体停留在特定细胞的表面，称为荧光抗体标记的靶细胞；将含有被标记细胞的混合细胞群混悬在一定容积的上样缓冲液中，再通过FACS的进样吸管孔，仪器就会将细胞悬液制成以单细胞排列的微细流束。当每一个细胞通过仪器的激光束照射时，带在细胞上的荧光就会被相应的激光束激活并发出对应的荧光，通过敏感的光电倍增管即可检测到从细胞表面发出的荧光。根据测得的散射光可得到细胞大小及颗粒状态的信息；而从荧光的发射强度则提供了结合在细胞上的抗体信息，进而也被反映了该细胞表面相应分子的表达情况。

抗体：指机体的免疫系统在抗原刺激下，由B淋巴细胞或记忆细胞增殖分化成的浆细胞所产生的、可与抗原发生特异性结合的免疫球蛋白。

多克隆抗体：动物脾脏有上百万种不同的B淋巴细胞系，合成不同的抗体。当机体受抗原刺激时，抗原分子上许多决定簇分别激活各个具有不同基因的B细胞。被激活的B细胞分裂增殖形成效应B细胞（浆细胞）和记忆B细胞，大量的浆细胞克隆合成和分泌大量的抗体分子分布到血液、体液中，即为多克隆抗体。

单克隆抗体：如果能选出一个制造一种专一抗体的浆细胞进行培养，就可得到由单细胞经分裂增殖而形成细胞群，即单克隆。单克隆细胞将合成针对一种抗原决定簇的抗体。

单克隆：把可在体外培养和大量增殖的小鼠骨髓瘤细胞与经抗原免疫后的纯系小鼠脾细胞融合，成为杂交细胞系，既具有瘤细胞易于在体外无限增殖的特性，又具有抗体形成细胞的合成和分泌特异性抗体的特点。将这种杂交瘤作单个细胞培养，形成单细胞系，即单克隆。

包被：将抗原或抗体固定在固相载体上的过程称为包被

印迹法：是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。

免疫荧光技术：将免疫学方法(抗原抗体特异结合)与荧光标记技术结合起来研究特异蛋白抗原在细胞内分布的方法。

荧光：是指一个分子或原子吸收激发光的能量后，电子从基态跃迁到激发态，当其回复至基态时，以发射光形式释放出能量，称为荧光。

荧光素：是一种可吸收激发光的光便能产生荧光，并能作为染料使用的有机化合物，亦称荧光色素。

发射光谱：是指固定激发波长，在不同波长下记录的样品发射荧光的强度。

激发光谱：是指固定检测发射波长，用不同波长的激发光激发样品记录的相应的荧光发射强度。